Akciğer kanserlerinde serumda ve bronkoalveoler lavaj (BAL)’da neopterin ve glutatyon peroksidazın prognostik değeri

ARAŞTIRMANIN ADI:

Akciğer kanserlerinde serumda ve bronkoalveoler lavaj (BAL)’da neopterin ve glutatyon peroksidazın prognostik değeri.

PROJENİN YÜRÜTÜLECEĞİ KLİNİK:

Atatürk Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi 8-Non Tbc Servisi

**Gülhane Askeri Tıp Akademisi Farmakoloji ABD

ARAŞTIRMANIN AMACI:

1-) Küçük hücreli akciğer kanseri ve küçük hücreli dışı akciğer kanserinin evresi ile serum ve BAL neopterin ve glutatyon peroksidaz düzeyleri arasında ilişki olup olmadığının saptanması,

2-) Küçük hücreli akciğer kanseri ve küçük hücreli dışı akciğer kanserlerinde yaşam süresi ile serum ve BAL neopterin ve glutatyon peroksidaz düzeyleri arasında ilişki olup olmadığının saptanması.

ARAŞTIRMANIN TANITIMI:

Akciğer kanserlerinde prognozun daha kapsamlı belirlenmesini sağlayacak ve bugünkü evreleme sistemine katkısı olabilecek pek çok parametre bulunmaktadır.Bu prognostik faktör hastaların özellikleri,histolojik ve labaratuvar parametreleri,genetik özelliklerini içermektedir.Bu konuda yapılmış bir çok çalışma bulunmaktadır.

Akciğer kanserlerinde, yüksek preoperatif üriner neopterin konsantrasyonu kötü prognozla kuvvetle ilişkili bulunmuş.Akciğer kanserlerinde rezeksiyon endikasyonu klinik evrelemeye göre belirlense de,solunum fonksiyon testleri ve performans skoru da bu konuda önemli faktörlerdir.Yapılan son çalışmalar gösteriyor ki,preoperatif neopterin düzeyi klinik evreden bağımsız olarak kötü prognoz için önemli bir faktördür.Bu nedenle yüksek neopterin düzeyi,genel durumu kötü hastalarda,konservatif tedavi kararı vermek için yardımcıdır.(3)

NEOPTERİN:

Neopterin 2-amino-4-okso-6-(1’,2’,3’-trihidroksipropil) pteridin yapısındadır. Kapalı formülü C₉H₁₁N₅O₄ tür. Molekül ağırlığı 253.22 dir. Biyolojik olarak guanozin trifosfattan sentezlenmektedir. Neopterinin D-eritro, L-eritro, D-treo, L-treo izomerleri bulunmaktadır.

Nötral veya alkali çözeltileri güçlü mavi fluoresans, asidik çözeltileri ise zayıf fluoresans vermektedir.

Biyopterin gibi neopterin de vücutta ayrıca dihidroneopterin ve tetrahidroneopterin şeklinde bulunabilir. Neopterinlerin D-izomeri olan türevleri insan metabolizmasında önemlidir.

Neopterin sadece insan ve primatlarda bulunmuştur. Sıçan, fare, kobay ve hamsterlerde ise neopterine rastlanmamıştır. İnsan ve primatlarda neopterinin tayin edilebildiği sıvılar tablo-1’de gösterilmiştir.

NEOPTERİN BİYOSENTEZİ:

Neopterin invivo olarak guanozin trifosfattan guanozin trifosfat siklohidrolaz 1 enzimi aracılığıyla sentezlenmektedir. Neopterin, konjuge olmayan pterinlerin sentez yolağında bir ara ürün olan 7,8-dihidroneopterin trifosfatın fosfatazlar tarafından hidrolizini takiben dihidroneopterin veya neopterin olarak atılmaktadır. Neopterinin beyaz kan hücrelerindeki biyosentezi Şekil-1’de gösterilmiştir. Neopterinler yalnızca aktive olmuş makrofajlarda sentezlenmektedir. Makrofajlarda neopterinden biyopterin sentezi için gerekli enzimler bulunmamaktadır. Neopterin makrofajlarda sentezini takiben plazmaya geçmektedir. Hücresel immun cevap boyunca T-lenfositlerin antijenik uyarımı ve ilgili hücrelerin antijenleriyle etkileşmenin yanı sıra hücrelerarası haberleşme iç değişikliğe uğramaktadır. Stimüle edilmiş T-lenfositlerden salınan γ-interferon ilk sinyallerdendir. γ-interferonun insanda periferal kan monosit/makrofajlarınca neopterin salıverilmesinin etkin bir indükleyicisi olduğu gösterilmiştir. Saflaştırılmış insan mononükleer hücreleriyle yapılan invitro çalışmalarda, aktive edilmiş T-lenfositlerden oluşan kültür süpernatanlarının ortama neopterin salıvermek üzere makrofajı indüklediği gösterilmiştir. Ayrıca saflaştırılmış γ-interferonun ilavesiyle de nepterin salınımı mümkün olmuştur. Monosit/makrofajların yalnızca γ-interferon ve çok yüksek konsantrasyonlardaki α-interferon ile invitro olarak stimüle edilebildiği saptanmıştır. Bununla birlikte başka bir çalışmada endotoksinin de neopterin biyosentezini arttırdığı ileri sürülmüştür.Aynı çalışmada γ-interferonun endotoksinle kostimüle edilebilme yeteneğinin de bulunduğu belirtilmiştir. Stimulasyonu takiben hem guanozin trifosfatın hem de guanozin trifosfat siklohidrolaz 1’in hücre içi düzeylerinde artış olduğu saptanmıştır ve böylece neopterin salınmaktadır

ssTABLO-1

Neopterin

BEYİN OMURİLİK SIVISI İnsan 3.300.24 Maymun 2.710.91 Köpek tayin edilememiştir. PLAZMA İnsan 3.000.21 Maymun 7.730.62 Köpek tayin edilememiştir. Sıçan  tayin edilememiştir. ERİTROSİTLER İnsan 2.710.15 Maymun 11.50.90 Köpek tayin edilememiştir. Sıçan tayin edilememiştir.

NEOPTERİNİN FİZYOLOJİK ROLÜ:

7,8-Dihidroneopterin trifosfat (NH₂P₃), L, 5, 6, 7, 8-tetrahidrobiyopterin prekürsörüdür. Tetrahidrobiyopterin, çeşitli monooksijenazlar için kofaktör rolü oynayarak katekolamin ve serotonin sentezinde, bir grup membran lipidinin oksidasyonunda görev almaktadır.

7,8-Dihidroneopterin mikroorganizmalarda folatların prekürsörüdür.

Triptofanın invivo ve invitro yıkımıyla insan makrofajlarından γ-interferonun indüksiyonuyla neopterin salıverilmesi arasında ilişki bulunmaktadır.

NEOPTERİN DÜZEYLERİ:

Sağlıklı yetişkin serumunda yaklaşık 2.6-8.7 nmol/L neopterin bulunmaktadır.Sağlıklı kişilerde serum neopterin düzeylerinin cinsiyete bağlı olmadığı ancak yaşa göre değişiklik gösterdiği saptanmıştır.

Neopterin veya biyopterin sadece idrarla itrah edilmektedir. Normal yetişkin idrarı herhangi bir ön işlem yapılmaksızın toplanıp incelendiğinde, mol kreatinin başına yaklaşık 200-300 μmol neopterin içermektedir. Toplam neopterin düzeyleri dihidroneopterin varlığından dolayı 2-5 katı kadar yüksek orandadır. İdrardaki neopterin düzeyleri kreatinin düzeylerine göre değerlendirilmektedir. Ortalama idrar neopterin/kreatinin oranının erkeklerde kadınlardakine kıyasla daha düşük bulunmuştur. Bu farkın, erkeklerde kreatinin düzeylerinin kadınlardakine göre daha yüksek olmasından kaynaklandığı belirtilmiştir.

Neopterin diğer vücut sıvılarında da lokal makrofaj aktivasyonunun bir göstergesi olarak bulunmuştur. Romatoid artrit hastalarının sinoviyal sıvılarında, aseptik meningoensefalit, Parkinson hastalığında beyin-omurilik sıvısında, pankreas greft rejeksiyonunun bir göstergesi olarak pankreatik sıvıda ve hamilelerde amniyotik sıvıda neopterin düzeyleri yüksek saptanmıştır.

FİZYOLOJİK DÖNEMLERDE NEOPTERİN DÜZEYLERİ

1-Hamilelik boyunca neopterin düzeyleri: Neopterinin hamileliğin son üç ayında, anne serumunda yükseldiği, neopterin ve biyopterin düzeylerinin amniyotik sıvıda yükseldiği, doğuma yakın dönemlerde, maternal serum düzeylerinden daha yüksek olduğu saptanmıştır. Amniyotik sıvıda pteridin konsantrasyonunun yüksek oluşu fetusta pterin metabolizmasının matürasyonunu yansıtabileceği öne sürülmüştür.

2-Menstrüel döneme göre neopterin düzeyleri: Altı sağlıklı kadında yapılan bir çalışmada, tam bir menstrüel dönem boyunca serum neopterin düzeylerinin normal sınırlar içinde kaldığı gösterilmiştir.

3-Yaşa göre neopterin düzeylerinin değişimi: 18-75 yaş arası bireylerin serum neopterin düzeylerinin önemli ölçüde farklılık göstermediği bildirilmiştir. Ancak 18 yaşından küçük ve 75 yaşından büyük bireylede serum neopterin düzeyleri yüksek bulunmuştur.

En yüksek idrar neopterin/kreatinin düzeyleri yenidoğanda gözlenmiştir. Çocuklarda düzeyler yaş artışına bağlı olarak azalmaktadır. En düşük neopterin düzeylerinin erkeklerde 26-45, kadınlarda ise 18-35 yaşları arasında bulunduğu belirlenmiştir. Neopterin düzeyleri daha yaşlı gruplarda, erkeklerde kadınlara kıyasla daha düşük oranda olmak üzere, biraz artmaktadır.

NEOPTERİN BİYORİTMİ:

1-Neopterin düzeylerinin gün içi değişimi: 24 saatlik süre içinde neopterin sabit oranda idrarla atılmaktadır. Neopterin düzeylerinin sabah erken saatlerde hafif arttığı bildirilmiştir. Bu nedenle 24 saatlik idrar örneğinde değil, her zaman aynı saatte, özellikle sabah ilk alınan idrar örneğinde neopterin düzeyinin belirlenmesinin yeterli olacağı belirtilmiştir.

2-Neopterin düzeylerinin yıl içi değişimi: Neopterin düzeylerinin herhangi bir hücresel immünite aktivasyonu söz konusu değilse bir yıl boyunca çok az değişme göstermekte, genellikle normal düzey sınırlarında kalmaktadır.

PATOLOJİK DURUMLARDA NEOPTERİN DÜZEYLERİ:

Bugün idrar ve serumda artmış neopterin düzeylerinin hücresel immünitenin aktivasyonu ile ilişkili olduğu açıklık kazanmıştır.Yüksek neopterin düzeyli hastalarda, invitro olarak aktive edilmiş T-lenfositlerden hazırlanan süpernatanlarla veya γ-interferon ile monosit/makrofajların aktive edilmesiyle neopterin salıverilmesinin ilişkisi bulunmuştur.

Bugün, başta idrar ve serum olmak üzere çeşitli biyolojik sıvılarda, artmış neopterin düzeyleri ile ilgili olduğu ileri sürülen hastalıklar tablo-2’de verilmiştir.

TABLO-2: Artmış neopterin düzeyleriyle ilgili olduğu ileri sürülen hastalıklar

Atipik fenilketonuride pterin metabolizmasının kalıtsal bozukluğu Allograft rejeksiyonlar/graft-versus-host hastalığı Endojen interferonların arttığı inflamatuar hastalıklar Viral enfeksiyonlar(örneğin HIV,CMV) İntrasellüler patojenler Diğer inflamatuar hastalıklar Sarkoidozis Çöliak hastalığı Multipl skleroz ve aseptik meningoensefalit Otoimmun hastalıklar Romatoid artrit Crohn hastalığı Sistemik lupus eritematozus Diabetıs mellitus tip 1 Ülseratif kolit Akut anterior üveit Otoimmun tiroidit Malign hastalıklar Genital tümörler Genito-üriner kanal tümörleri Akciğer kanseri Gastrointestinal karsinoma Pankreatik karsinoma Hematolojik neoplazmlar

ŞEKİL-1: Beyaz kan hücrelerinde neopterin biyosentezi

HÜCRE İÇİ (Beyaz kan hücreleri) Guanozin Trifosfat GuanozinTrifosfatSiklohidrolaz 7,8-Dihidroneopterin Trifosfat   7,8-DihidroneopterinRedüktaz Makrofajlarda 6-puriviltetrahidropterinsentetaz 5,6,7,8-Tetrahidrobiopterin(BH4)

HÜCRE DIŞI (Makrofajlar) 7-8-Dihidroneopterin Neopterin

2-GLUTATYON PEROKSİDAZ:

Hidroperoksidazlar, zararlı peroksitlere karşı vücudu korurlar. Peroksid birikimi serbest radikal üretimine neden olabilir. Bu da membranları parçalayarak olası kanser ve arterioskleroza yol açabilir.

Peroksidazlar, sütte, lökositlerde, trombositlerde eikozonoid metabolizması ile ilgili diğer dokularda bulunmuştur. Peroksidazlar tarafından katalize olan reaksiyonlarda hidrojen peroksit elektron akseptörü olarak hareket eden askorbat, kinonlar ve sitokrom C gibi birçok maddenin zararına olacak şekilde indirgenir. Peroksidaz tarafından katalize olan reaksiyon komplekstir ancak reaksiyonun tümü aşağıdaki şekilde oluşur.

H₂O₂+A₂ Peroksidaz 2H₂O+A

Eritrositlerde ve diğer dokularda prostetik grup olarak selenyum içeren glutatyon peroksidaz enzimi indirgenmiş glutatyon tarafından H₂O₂ ve lipit peroksitlerinin parçalanmasını katalize eder. Böylelikle membran C lipidlerini ve hemoglobini peroksitlerin oksidasyonuna korumada karşı korur.Eritrositleri hemolizden korumada glutatyon peroksidazın görevi glutatyon peroksidaz tarafından katalize edilen bir reaksiyonla eritrosit içindeki H₂O₂’i ortamdan uzaklaştırmaktır.

Glutatyon redüktaz

G_S_S_G+NADPH+H 2G+5H+NADP⁺

2G_S_H+H₂O₂ Glutatyon peroksidaz, Selenyum G_S_S_G+2H₂O

Bu reaksiyon önemlidir. Çünkü H₂O₂’nin birikimi hemoglobinin methemoglobine oksidasyon hızını arttırmak suretiyle eritrositin yaşam süresini kısaltabilir. Glutatyon peroksidaz birçok dokuda bulunan doğal bir antioksidandır. Bu H₂O₂’e ek olarak organik peroksitlerede saldırır. E vitamini ile birlikte lipit peroksidasyonuna karşı vücut savunmasının bir kısmını oluşturur. Oksijenle karşılaştırılan lipitlerin peroksidasyonu (otooksidasyonu) besin maddelerinin sadece bozulmasından sorumlu olmayıp ayrıca kansere, inflamatuar hastalıklara, ateroskleroza, yaşlanma vb. durumlara neden olabilen doku hasarındandan da sorumludur. Metilen ile kesintiye uğramış çift bağları içeren yağ asitlerinin, peroksitlerinin oluşumu sırasında husule gelen serbest radikaller (ROO^–,RO^–,OH) tarafından zararlı etkiler başlatılır. Glutatyon peroksidaz serbest radikaller ile reaksiyona girerek antioksidan etki oluşturur.

Bazı kanserlerin insidansı ile birlikte kan selenyumu ve glutatyon peroksidaz aktivitesinin düşük düzeyleri arasında ilişki olduğu bildirilmiştir.

MATERYAL-METOD:

Çalışmaya alınacak olgular 2 gruba ayrılacak.

Grup A: Akciğer kanseri tanısı olanlar

1-Küçük hücreli dışı akciğer kanseri

2-Küçük hücreli akciğer kanseri

Grup B: Sağlıklı kontrol grubu

Grup A: Bronkoskopik biyopsi ile tanı konulan ve kemoterapi almamış hastalar olacak.

Grup B: Hemoptizi, ses kısıklığı, inatçı-kronik öksürük, hiler dolgunluk etyolojisi araştırılacak sağlıklı kişiler olacak.

Bu çalışma ayrıca 2 şekilde ayrıştırılacaktır.

1-Son 6 ay içinde %5 veya daha az kilo kaybedenlere karşılık %5’den fazla kilo kaybedenler.

2-Performans durumu 0-1 olanlara karşılık 3-4 olanlar.

Çalışmaya alınma kriterleri:

1-) Bronkoskopi için kontrendikasyon veya relatif kontrendikasyonun olmaması.

2-) Daha önce radyoterapi veya kemoterapi almaması.

3-) 18 yaşından büyük olması.

4-) Uygun hematolojik, biyokimyasal,pulmoner fonksiyonları olanlar.

5-) Yazılı onay verenler

Çalışmaya alınmama kriterleri:

1-) HIV seropozitifliği.

2-) HBV,HCV seropozitiflik.

3-) Otoimmün hastalık.

4-) Konjestif kalp yetmezliği

5-) Akciğer tüberkülozu

6-) Diabetes mellitus

7-) Kronik karaciğer hastalığı.

8-) Kronik böbrek yetmezliği.

9-) Malign hastalıklar.

Olguların anamnezi alınıp, fizik muayenesi yapıldıktan sonra radyolojik ve biyokimyasal (üre, karaciğer enzimleri, kan şekeri, kreatinin, bilirubin) tetkikleri yapılacak.

FOB ile BAL elde edilmesi ERS kriterlerine göre gerçekleştirilecek. Hastanın patolojisinin olduğu akciğer segmenti içine FOB’un ucu yerleştirilip, 20’şer mililitrelik serum fizyolojik verilip, toplam 100 ml sıvı filtre edilmeden geri alınacak.

Kontrol grubunda BAL orta lob yada linguladan alınarak, BAL sıvısı santrifüj edildikten sonra –20 C de saklanacaktır.

Olguların serumları FOB öncesi alınacak ve 20 dakika oda sıcaklığında bekletilip, santrifüj edilerek –20 C de saklanacak.

Neopterin ve glutatyon peroksidaz düzeylerinin serum ve BAL’da saptanması için …………. kiti kullanılacak

Neopterin ölçümlerinin standardizasyonu için BAL sıvısına kolaylıkla geçebilen ve düşük molekül ağırlığına sahip olan üre kullanılacak.

KAYNAKLAR:

1-Wachter H, Weiss G, Fuchs D:Neopterin,biochemistry and clinical use as a marker for cellular immune reactions.Int Arch Allergy Immunol 1993;101:1-6

2-K. Hassaan Mohammed,A.A.M.T: Mobasher,Abdel-Rahim I. Yousef,Adel Salah, I.Z. El-Nagger,A.H.A. Ghoneim,Richard W. Light:A novel marker for cell mediated immunity in patients with pulmonery tuberculosis and lung cancer.Chest 2001;119:776-780

3-R. Prommegger, B. Widner, C. Murr, A.Unger, D. Fuchs, G. M. Salzer:Neopterin:A prognostic variable in operations for lung cancer.Ann Thorac Surg 2000;70:1861-4

bilgi